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          抗體藥純化工藝過程中常見問題及解決方案

          2023-12-11 14:49:21

          mAb純化工藝過程中常見問題及解決方案

          單克隆抗體制備過程中,細(xì)胞培養(yǎng)的上清液經(jīng)過深層過濾等方式進(jìn)行澄清,澄清后用rProtein A Seplife Suno捕獲及初步純化,初步純化在經(jīng)低pH(pH3.4-3.8)滅活病毒,對(duì)于在低pH環(huán)境中不穩(wěn)定的mAb可采用S/D的方式滅活病毒,滅活病毒后用陽(yáng)離子交換 SP Large Scale 吸附洗脫模式繼續(xù)純化,進(jìn)一步去除HCP及親和層析過程中可能脫落的 Protein A 親和配體,同時(shí)陽(yáng)離子交換層析過程通過改變pH的方式洗脫也是去除電荷異構(gòu)體的主要方式,陽(yáng)離子交換層析后用陰離子交換層析Q Large Scale進(jìn)一步精細(xì)純化去除痕量的病毒及HCP等雜質(zhì),聚集體及片段的去除也多在離子交換層析階段去除。經(jīng)基于Protein A親和層析平臺(tái)技術(shù)的三步層析后,在通過UF/DF的方式置換緩沖液,納濾除病毒等即可制劑化。


          mAb純化過程中常見問題

          Protein A親和洗脫過程中產(chǎn)生沉淀:

          高載量的Protein A親和層析填料結(jié)合mAb的過程中,在填料表面高密度聚集,疏水性強(qiáng)的mAb分子容易高密度聚集沉淀,這個(gè)時(shí)候可以嘗試在洗脫液中添加一些蛋白增溶劑,防止高密度聚體引起的沉淀,如 200mM-500mM 的 Arg 或 1M尿素等。另一方面在低pH洗脫過程中,mAb分子在低pH環(huán)境中不穩(wěn)定時(shí)也容易形成沉淀,這時(shí)可用較高的pH如pH4.0在加一定量如500mM Arg進(jìn)行弱洗脫,同時(shí)洗脫下來要立馬用 1M Tris等緩沖液中和pH。


          Protein A親和層析洗脫液中HCP殘留過高:

          關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào),關(guān)注后,在搜索處搜索HCP,查看《抗體純化中Protein A親和層析階段HCP去除策略》推文。另一種方式是親和層析后在進(jìn)行一步深層過濾,這時(shí)選擇的深層過濾膜組件可選擇帶陰離子交換作用的膜組件。


          Protein A親和層析洗脫液中聚集體含量偏高:

          由于mAb分子在Protein A親和層析填料中高密度產(chǎn)生聚集體,這時(shí)可通過降低mAb的結(jié)合量一方面減少保留時(shí)間另一方面降低上樣量,同時(shí)也可通過在結(jié)合緩沖液中增加一些蛋白增溶劑如尿素,鹽等物質(zhì)減弱mAb分子之間的作用,而減少洗脫液中的聚集體含量。


          低pH病毒滅活過程中活性損失大:

          在一些mAb分子低pH病毒滅活過程中,由于其AA組成,等電點(diǎn),穩(wěn)定性等因素可能導(dǎo)致mAb分子降解及聚集等而影響mAb的活性收率,這時(shí)就要考慮其它病毒滅活方式,如S/D。S即solvent,指有機(jī)溶劑,D即detergent,指去垢劑,S/D病毒滅活法即指采用有機(jī)溶劑和/或去垢劑對(duì)產(chǎn)品中可能存在的病毒顆粒進(jìn)行滅活,使其失去感染活性的一種病毒滅活方法。S/D病毒滅活時(shí),最主要使用的有機(jī)溶劑為TNBP;最主要使用的非離子型去污劑為Triton X-100、Tween 80,其中Triton X-100去垢劑能力更強(qiáng)。病毒滅活時(shí),TNBP可單獨(dú)使用,也可以與去垢劑中的任意一種聯(lián)合使用。S/D病毒滅活時(shí),TNBP常用濃度0.1%-0.5%,Triton X-100濃度常用1%。


          離子交換層析后電荷異構(gòu)體含量高:

          關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào),關(guān)注后,在搜索處搜索電荷異構(gòu)體,查看《單克隆抗體電荷異構(gòu)體去除策略》推文。


          離子交換層析精純后聚集體及片段含量高:

          關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào),關(guān)注后,在搜索處搜索聚集體,查看《抗體藥制備工藝中聚集體及片段的去除解決方案》推文。


          精純后一些糖基化分子的去除:

          關(guān)注藍(lán)曉生命科學(xué)公眾號(hào),關(guān)注后,在搜索處搜索糖基化,查看《糖基化蛋白的分離純化》推文。


          小結(jié):此文總結(jié)是藍(lán)曉科技應(yīng)用開發(fā)部,在純化抗體中多個(gè)項(xiàng)目工藝過程的總結(jié),在不同的mAb分子純化過程中會(huì)有所差異,僅供參考,更多mAb純化過程中常見問題及解決方案,請(qǐng)留言補(bǔ)充。




          mAb下游純化案例

          基于Protein A親和平臺(tái)技術(shù)三步層析法純化mAb:

          樣品:某mAb原液經(jīng)深層過濾后的上清液

          圖1:rProtein A Seplife Suno純化mAb色譜曲線


          圖2:SP Large Scale精細(xì)純化mAb色譜曲線

          圖3:Q Large Scale精細(xì)純化mAb色譜曲線

          圖4:三步層析后HPLC-SEC檢測(cè)圖


          純化結(jié)果:mAb三步層析法純化后SEC純度99.15%;總收率 84.50%;HCP殘留5 ppm,如表1.

          表1:藍(lán)曉科技三步層析法純化mAb結(jié)果


          rProtein A Seplife Suno:

          是藍(lán)曉科技應(yīng)對(duì)抗體客戶需求推出的Protein A親和層析填料,以球形,高交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質(zhì),通過自主創(chuàng)新技術(shù)將耐堿性重組蛋白A鍵合到該基質(zhì)上。可以特異性地與抗體的Fc區(qū)結(jié)合,用于抗體(單抗和多抗)的分離純化,只需一步親和層析,即可從腹水、血清或培養(yǎng)液等樣品中得到高純度的抗體。在mAb純化中用于捕獲及初步純化,mAb載量高達(dá)80mg/ml。

          藍(lán)曉科技自主開發(fā)擁有專利的rProtein A系列蛋白A親和填料于2022年7月14日通過美國(guó)FDA DMF備案(MF#:037326),成為國(guó)內(nèi)為數(shù)不多的通過FDA DMF備案的國(guó)產(chǎn)填料供應(yīng)商。這意味著使用藍(lán)曉科技相關(guān)產(chǎn)品的客戶,在向FDA提交進(jìn)行新藥注冊(cè)的監(jiān)管備案文件中可直接引用DMF備案資料,而無需再提供有關(guān)原料和輔料的具體信息。


          rProtein A Seplife Accel 50

          藍(lán)曉科技為了滿足單克隆抗體(mAb),雙特異性抗體(bsAb),多特異性抗體,抗體偶聯(lián)藥(ADC)等各種抗體藥大規(guī)模生產(chǎn)需求設(shè)計(jì)開發(fā)的以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為基質(zhì),偶聯(lián)高耐堿性重組Protein A 配基親和層析介質(zhì)。該產(chǎn)品結(jié)合了藍(lán)曉科技專有噴射法單分散微球制備、精準(zhǔn)造孔、表面修飾(長(zhǎng)鏈間隔臂親水改性),配基偶聯(lián)等技術(shù)使得產(chǎn)品具有高剛性、低反壓、高動(dòng)態(tài)載量、媲美軟膠的生物相溶性,聚體去除效率高等優(yōu)點(diǎn),與公司瓊脂糖基質(zhì)Protein A親和介質(zhì)形成完整的產(chǎn)品組合,可有效滿足不同客戶多元化的應(yīng)用場(chǎng)景。


          SP/Q Large Scale 

          用于mAb純化過程中精細(xì)純化,去除親和層析過程中可能脫落的Protein A及HCP,電荷異構(gòu)體,聚集體及片段。此系列填料為高剛性瓊脂糖微球填料,耐壓可達(dá)0.5MPa,廣泛用于生物分子的分離純化。


          Seplife LXPM Q/SP 5504M/S

          聚合物離子交換層析填料,其耐壓可達(dá)0.8MPa,用于mAb中度及精細(xì)純化。


          MMC/MA Large Scale 

          以離子交換為主同時(shí)兼具一定的疏水作用力的多模式層析填料,pH伴隨鹽雙梯度洗脫模式廣泛用于mAb純化過程中聚集體及片段的去除。


          Seplife S-200

          用于mAb純化過程中精純階段殘留的聚集體及片段的去除。


          Boricacid Seplife 4FF及硬膠Boricacid Seplife LXPM 5504

          由于硼酸反應(yīng)的專一性,硼酸鹽親和材料近年來受到越來越多的關(guān)注。已證實(shí)硼酸鹽親和材料可以有效分離包括糖蛋白在內(nèi)的含順式二羥基結(jié)構(gòu)的化合物。硼酸分子與糖鏈上的順式二羥基結(jié)構(gòu)在堿性條件下形成環(huán)酯,該生成物在酸性條件下容易水解,反應(yīng)原理如圖2所示?;谠摽赡娣磻?yīng),可利用硼酸鹽親和材料選擇性檢測(cè)分離富集糖基化蛋白。用于mAb純化過程中糖基化蛋白的去除。

          圖5:硼酸親和層析分離糖基化蛋白的原理



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