重組亞單位新冠疫苗

新冠病毒（SARS-CoV-2 ）包含S蛋白 (spike protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)，E 蛋白(envelope protein)和M 蛋白(membrane protein)四種結(jié)構(gòu)蛋白(如圖1)1。其中S蛋白負(fù)責(zé)病毒識(shí)別宿主細(xì)胞受體并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，是病毒打開(kāi)宿主細(xì)胞“大門(mén)”的“鑰匙”，也是病毒感染后引起宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和性抗體的主要靶標(biāo)，因此S蛋白在新冠疫苗開(kāi)發(fā)中備受關(guān)注。新冠基因工程重組亞單位疫苗，是通過(guò)基因工程的方法，在體外制備新冠S蛋白（刺突糖蛋白）或者S蛋白片段制備而成的疫苗，所以新冠基因工程重組蛋白疫苗也有多種技術(shù)路線。

中國(guó)生物研究院基于自主建立的計(jì)算結(jié)構(gòu)疫苗學(xué)技術(shù)平臺(tái)，在第 一 代重組新冠疫苗（NVSI-06-07）的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)流行株突變位點(diǎn)的進(jìn)化規(guī)律和免疫逃逸能力進(jìn)行計(jì)算分析，設(shè)計(jì)研發(fā)的第二代廣譜新冠疫苗（突變集成三聚化RBD）。

1.基因序列設(shè)計(jì)：在體外制備新冠S蛋白（刺突糖蛋白）或者S蛋白片段制備而成的疫苗，目前選取RBD片段做抗原基因被廣泛使用于疫苗的開(kāi)發(fā)，序列設(shè)計(jì)時(shí)將RBD串聯(lián)起來(lái)以重組表達(dá)同型二聚體及三聚體，在基因序列設(shè)計(jì)時(shí)加入His-tag序列或者Fc片段，通常加在C端，蛋白表達(dá)后切除His-tag或Fc對(duì)蛋白的性質(zhì)沒(méi)有影響，若加在N端，切除后對(duì)蛋白的性質(zhì)可能會(huì)造成一定的影響，同時(shí)加入His-tag或Fc序列也要考慮酶切位點(diǎn)序列。

2.克?。簩?gòu)建好的基因轉(zhuǎn)讓至CHO或者Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)中。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：略

4.固液分離：離心去除細(xì)胞等固形物。

5.澄清：CHO或Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RBD及RBD二聚體及三聚體均分泌在細(xì)胞培養(yǎng)液中，離心后的上清液用深層過(guò)濾等微濾膜組件澄清處理。

6.純化：

6.1.RBD單體純化：澄清后的抗原原液根據(jù)克隆時(shí)帶的標(biāo)簽，用Ni Seplife FF(TED)-His標(biāo)簽，rProtein A Seplife Suno-Fc標(biāo)簽進(jìn)行快速捕獲，去除大量的HCP等雜質(zhì)，減少體積；親和層析后再經(jīng)凝膠過(guò)濾層析Seplife S-100中度純化去除聚集體及片段，后再經(jīng)離子交換層析Q Large Scale 去除痕量的HCP及內(nèi)毒素。此過(guò)程中要注意緩沖液及鹽濃度對(duì)過(guò)程的影響，必要的情況下要進(jìn)行超濾伴隨洗濾的方式或者用凝膠過(guò)濾層析Seplife G-25 M進(jìn)行緩沖液置換，同時(shí)要注意緩沖液對(duì)RBD收率及穩(wěn)定性的影響，可以嘗試添加一些添加劑如甘油，精氨酸等來(lái)提高RBD的穩(wěn)定性，減少沉淀及聚集體的產(chǎn)生。

6.2.RBD二聚體純化：捕獲階段同RBD單體捕獲，根據(jù)所帶標(biāo)簽選擇對(duì)應(yīng)的親和層析；捕獲的RBD二聚體去除多聚體及片段時(shí)選用Seplife S-200凝膠過(guò)濾填料純化，此工序也可嘗試用多模式層析MA Large Sacle 采用pH伴隨鹽雙梯度洗脫模式進(jìn)行分離，分離后根據(jù)結(jié)果再用離子交換層析去除痕量的HCP及內(nèi)毒素。

6.3RBD三聚體純化：同RBD二聚體純化。

7.調(diào)整抗原蛋白濃度及置換緩沖液:用超濾伴隨洗濾的方式調(diào)整抗原蛋白濃度及置換緩沖液。

8.除菌過(guò)濾：用0.22um的濾芯除菌過(guò)濾。

9.制劑化（略）。

第二代重組亞單位新冠疫苗：在原型株+Delta + Omicron 等變異株，及對(duì)流行株突變位點(diǎn)的進(jìn)化規(guī)律和免疫逃逸能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)行RBD序列優(yōu)化設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，同樣有RBD單體，RBD二聚體，RBD三聚體等多種設(shè)計(jì)路線，下游工藝同原型株株RBD亞單位疫苗下游工藝整體思路。

2、An Y., Li S., Jin X, et al.A tandem-repeat dimeric RBD protein-based COVID-19 vaccine ZF2001 protects miceand nonhuman primates. bioRxiv 2021.03.11.434928;

3、專(zhuān)利號(hào)：CN201511021538.8（一種基于二聚化的受體結(jié)合區(qū)亞單位冠狀病毒疫苗）

4、Tectonic conformational changesof a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion

5、Structure-based design ofprefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes

6、Ma X, Zou F, YuF, et al. NanoparticleVaccines Based on the Receptor Binding Domain(RBD) and Heptad Repeat (HR) ofSARS-CoV-2 Elicit Robust Protective Immune Responses. Immunity. 2020 Dec15;53(6)