親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常在純化工藝的前期應(yīng)用，可將目標(biāo)物質(zhì)快速的從樣本中捕獲出來，基于后續(xù)應(yīng)用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)不結(jié)合

Q:標(biāo)簽未翻譯或標(biāo)簽被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部

A:檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置，標(biāo)簽移到其它位置扔被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部時(shí)，就要將標(biāo)簽暴露出來（如用尿素變性，但尿素變性性只有部分標(biāo)簽蛋白可以和親和填料結(jié)合如His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合填料，但GST標(biāo)簽和GST填料就不能在親和結(jié)合）

Q:結(jié)合緩沖液不合適及層析柱沒平衡好

A:調(diào)整緩沖液，如金屬螯合介質(zhì)和His標(biāo)簽蛋白結(jié)合時(shí)pH應(yīng)在7.3-8.5之間，在如肝素親和介質(zhì)和DNA聚合酶結(jié)合時(shí)鹽濃度太高影響結(jié)合，應(yīng)控制在50mM以下。層析柱沒平衡好，柱床體系中的環(huán)境如pH，離子強(qiáng)度也會(huì)影響結(jié)合，層析上樣前要充分的平衡層析柱。

Q:結(jié)合時(shí)間不夠

A:降低上樣流速讓蛋白和介質(zhì)有充分的接觸時(shí)間。

Q:層析介質(zhì)選的不合適

A:親和介質(zhì)分類，一類是特異性結(jié)合一種蛋白，另一類是特異性結(jié)合一類蛋白。如蛋白a介質(zhì)結(jié)合一種蛋白，而肝素介質(zhì)結(jié)合一類蛋白。所以選擇的時(shí)侯我們一定要了解其原理。

親和層析介質(zhì)的分類

Q:蘇州藍(lán)曉生物都有那些親和介質(zhì)

A:金屬螯合親和層析介質(zhì)

?Ni Seplife FF(IDA/NTA/TED)

GST標(biāo)簽蛋白純化親和介質(zhì)  

?Glutathione Seplife 4FF    

抗體純化親和介質(zhì)    

?rProtein A Seplife Suni    

?rProtein A Seplife Suno    

?rProtein G Seplife 4FF    

質(zhì)粒DNA親和層析介質(zhì)    

?Plasmid Seplife LX    

絲氨酸蛋白酶親和層析介質(zhì)    

?Benzamidine Seplife 4FF    

肝素親和層析介質(zhì)    

?Heparin Seplife CL-6B    

?Heparin Seplife FF    

硼酸親和層析介質(zhì)    

?Boricacid Seplife 4FF    

藍(lán)色染料親和層析介質(zhì)    

?Blue Seplife FF    

?Red Seplife FF    

預(yù)活化介質(zhì)    

?Epoxy Activated Seplife 4FF    

?CNBr Activated Aeplife 4FF    

蛋白質(zhì)結(jié)合在親和柱床中未洗脫出

Q:蛋白和介質(zhì)結(jié)合力過強(qiáng)

A:增加洗脫強(qiáng)度，比如his蛋白和鎳柱結(jié)合，可以增加取代基咪唑的濃度。

Q:蛋白聚集在層析柱上

A:通過調(diào)整層析過程的緩沖液增加蛋白的穩(wěn)定性，改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。聚集在層析柱上時(shí)就要對(duì)層析柱進(jìn)行CIP清洗。

蛋白經(jīng)親和層析后低分辨率（洗脫后純度低）

Q:層析過程流速的影響

A:調(diào)整層析過程的流速，流速影響蛋白質(zhì)和介質(zhì)的親和力，層析時(shí)要選擇合適的流速。

Q:柱床未充分淋洗

A:上樣后，要對(duì)柱床進(jìn)行充分的淋洗，將未和介質(zhì)結(jié)合的留在介質(zhì)顆粒間隙，孔內(nèi)的蛋白洗出來，在洗脫。

Q:蛋白之間的非特性結(jié)合

A:優(yōu)化體系緩沖液，比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結(jié)合。

Q:介質(zhì)的非特異性結(jié)合

A:優(yōu)化緩沖液，減少層析過程的非特異性結(jié)合，如His蛋白用金屬螯合填料純化時(shí)，可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉，減少蛋白和介質(zhì)的非特異性結(jié)合。

Q:洗脫過程的影響

A:如肝素柱子洗脫過程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性，His標(biāo)簽蛋白和金屬螯合介質(zhì)結(jié)合后，洗脫時(shí)拉咪唑梯度可以提高純度。

蛋白質(zhì)純化過程中失活

Q:蛋白去折疊或聚集

A:優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。

Q:純化過程中保持蛋白的活性的輔助因子被去除

A:如一些酶類的活性需要金屬離子輔助其活性，在純化過程中就要添加蛋白的活性輔助因子。